室溫下活體葉綠素熒光及光誘導的熒光變化由光系統(tǒng)II中激發(fā)的峰值在685 nm左右的葉綠素a熒光主導。光系統(tǒng)I熒光，F(xiàn)（I），峰值約730 nm，到目前為止被認為在活體中是恒定的。在這里，我們提出證據(jù)表明在綠色單細胞藻類小球藻、藍藻聚球藻和淡綠色常春藤葉片中，F(xiàn)（I）對可變熒光有顯著貢獻。本研究用多激發(fā)波長調(diào)制葉綠素熒光儀Multi-Color-PAM測量了440 nm強光在小球藻稀懸液中誘導的多相熒光上升（O-I1-I2-P），檢測波長分別在700 nm以上（F>700）和710 nm以下（F<710）。通過對F>700和F<710記錄的10條曲線取平均值，即使是很小的差異也能得到可靠的評估。對構(gòu)成特定F（II）響應的O-I1相振幅進行標準化后，兩次記錄的O-I1-I2相接近相同，但F>700的I2-P相為F<710的1.42倍。用625 nm強光化光在暗狀態(tài)2下對聚球藻進行的類似測量中，在O-I1標準化后，F(xiàn)>700的I2-P相甚至超過F<710的I2-P相1.99倍。在對小球藻的測量中，中等光化背景光和質(zhì)體醌拮抗劑DBMIB抑制了其I2-P相及PSI表觀可變熒光Fv（I）。對葉片的類似測量由于不可避免的光強梯度及由此產(chǎn)生的F>700和F<710的異質(zhì)來源而變得難以確定。但是一片淡綠色的常春藤幼葉定性地與懸浮液的結(jié)果相似，因此強烈地暗示葉片中也存在Fv（I）。

本研究是德國WALZ首席科學家，PAM熒光儀發(fā)明人，德國伍茲堡大學教授Ulrich Schreiber使用多激發(fā)波長調(diào)制葉綠素熒光儀Multi-Color-PAM做出的。該設備在具備極高靈敏度的同時又具有很高的時間分辨率，非常適合于研究不同光質(zhì)的強光誘導下葉綠素熒光快速細微的變化過程。文章發(fā)表在2021年1月的Photosynthesis Research上。

圖1 用于測量F>700（1 mm RG9+2 mm低熒光RG665）和F<710（短通710 nm+2 mm低熒光RG665）的探測器濾光片組的透射光譜

圖2 使用Multi-Color-PAM在F>700(紅色)和F<710(藍色)測得的小球藻多相熒光上升曲線的比較。440 nm脈沖調(diào)制測量光和440 nm光化光（4018 μmol m?2 s?1）。葉綠素含量200 μg L-1。每隔5分鐘交替測量10次F>700和F<710曲線的平均值。弱遠紅光背景（1 μmol m?2 s?1 730 nm），用于誘導PS II供體和受體側(cè)狀態(tài)的標準參考條件，并考慮長期再現(xiàn)性。圖為PamWin-3軟件快速動力學窗口的原始截圖。

圖3 對F>700響應進行重縮放后，F(xiàn)>700(紅色)和F<710(藍色)信號的比較，以給出與F<710響應中相同的O-I1相位振幅。根據(jù)圖2所示的原始數(shù)據(jù)得出。使用4018 μmol m?2 s?1 440 nm。I1平臺在1 ms時到達(綠色垂直折線)。黑色垂直虛線放置在40 ms處，以標記I2-P階段的開始。使用Schreiber（1986）的原始命名法表示特征熒光水平O=Fo、I1、I2和P=Fm。a對數(shù)時間刻度。b線性時間刻度

圖4 標準化O-I1 Fv>700和Fv<710曲線的比較。通過減去各自Fo值從圖3中的數(shù)據(jù)導出

圖5 根據(jù)圖4所示的標準化O-I1 Fv>700和Fv<710曲線之間的差異得出的可變PS I熒光Fv（I）的動力學。坐標縮放如圖3所示。a組，線性時間刻度。b組，對數(shù)時間刻度

圖6 用96 μmol m?2 s?1 440 nm在恒定照光狀態(tài)下測量的多相熒光上升曲線導出的標準化O-I1 Fv>700和Fv<710曲線的比較。除背景照明外，使用相同的樣品進行與圖4的實驗相同的條件。F>700和F<710記錄各取10個平均值。比例與圖4相同。使用4018 μmol m?2 s?1 440 nm

圖7 在1 μM DBMIB存在下測量的多相熒光上升曲線得出的標準化O-I1 Fv>700和Fv<710曲線的比較。另外，與圖4的實驗條件相同，用與圖4和圖6的測量樣品相同。在弱遠紅光背景下，連續(xù)光照終止后2 h，在DBMIB存在下開始測量?？s放比例與圖4和6相同。應用4018 μmolm?2 s?1 440 nm

圖8 將標準化O-I1的F>700響應(紅色)反褶積為小球藻中的F（I）(黑色)和F（II）(綠色)分量。在假設I2-P完全由Fv（I）引起的情況下，通過標準化I2-P對F（I）進行重標度。F（II）(綠色)由標準化O-I1 F>700(紅色)減去標準化I2-P F（I）(黑色)得到。表明了Fo（I）和Fo（II）貢獻的振幅

圖9 根據(jù)在>700 nm和<710 nm處測量的強光照開始時誘導的多相熒光上升曲線的平行記錄，在暗色素狀態(tài)2下，聚球藻中Fv（I）的定量。激發(fā)：脈沖調(diào)制440 nm ML。光化光：4229 m?2 s?1 625 nm加891 μmol m?2 s?1 440 nm（高頻脈沖調(diào)制ML）。每條曲線是4次記錄的平均值，每5分鐘交替測量一次F>700和F<710。a對F>700響應重新縮放后的F>700(紅色)和F<710(藍色)信號進行比較，得出與F<710響應相同的O-I1相振幅。b O-I1平衡Fv>700和Fv<710反應的比較。顯示了特征熒光水平。

圖10 將標準化O-I1的F>700響應(紅色)反褶積為黑暗狀態(tài)2下的聚球藻的F（I）(黑色)和F（II）(綠色)分量。在假設I2-P完全由Fv（I）引起的情況下，對F（I）進行重定標。F（II）(綠色)由標準化O-I1的F>700(紅色)減去標準化I2-P的F（I）(黑色)得到。顯示了Fo（I）和Fo（II）貢獻的振幅

圖11 從淺綠色常春藤幼葉表面測量的F>700(紅色)和F<710(藍色)光誘導變化的比較。在1 ms下應用單周轉(zhuǎn)飽和閃光以誘導QA最大還原。重新縮放F>700響應，以獲得與F<710響應相同的O-I1相位振幅。入射光強度：7800 μmol m?2 s?1 440 nm。a O-I1平衡可變熒光產(chǎn)額的比較。b初步反褶積F（I）(黑色)和F（II）(綠色)對整個Fv>700響應(紅色)的貢獻，遵循與圖8和10中應用的相同程序，分別為小球藻和聚球藻。

本研究結(jié)果為活體內(nèi)存在可變PS I熒光Fv（I）提供了有力證據(jù)，正如Lazar（2013）在生物信息學模擬基礎上提出的假設。這一證據(jù)是通過對綠藻和藍藻稀懸浮液中強光誘導的長波和短波發(fā)射帶（F>700和F<710）熒光產(chǎn)額變化的相對簡單的比較測量獲得的。F>700和F<710的多相上升動力學的定量比較依賴于一個公認的概念，即初始O-I1上升相反映了PS-II反應中心的關閉，因此可以認為是一種特殊的F（II）反應。在標準化F>700和F<710響應中O-I1相位的振幅后，兩個信號中的所有F（II）分量應相等，而任何F（I）應導致F>700大于F<710信號。這對Fo和Fv都是適用的。我們發(fā)現(xiàn)，不僅Fo>700大于Fo<710，而且Fv>700大于F<710。小球藻和聚球藻在I2水平上表現(xiàn)出相同的誘導動力學，但在F>700時，隨后的I2-P相振幅明顯增大。這一發(fā)現(xiàn)得出了I2-P含有Fv（I）的結(jié)論，小球藻的光誘導變化如圖5所示。這些結(jié)果令人印象深刻地支持了Lazar（2013）關于Fv（I）預測振幅和動力學性質(zhì)的生物信息學理論預測。因此，Dusan Lazar的模擬和我們的實驗證據(jù)可以被認為是互補的，相互支持的。

Dusan Lazar和我們的結(jié)論是基于一個普遍接受的假設，即綠色植物和藻類的熒光發(fā)射源于色素系統(tǒng)II或色素系統(tǒng)I，后者的發(fā)射在波長>700 nm時更為明顯。當這一假設被接受時，很難找到合理的替代理論來解釋歸一化O-I1的F>700曲線中I2-P相的相對差異，而非接近等于F<710曲線。然而，由于PSⅠ受體的耗盡（在Dusan-Lazar的模擬中誘導Fv（I））以及PSⅡ熒光的增加，不能完全排除這種可能性，應該通過仔細的未來實驗進行研究確證。PS-II熒光的這種增加不一定是由于PS-II反應中心的光化學猝滅的抑制引起的，可能是由于某種形式的非光化學猝滅的抑制引起的，必須闡明其特性。推測這種猝滅的候選物可能是氧化的PQ（Vernotte等，1979年）或具有相對低效供體側(cè)的PS II的一部分，其中氧化的酪氨酸Z和P680+在強光下積聚（Steffen等，2005年）。

Chukhutsina等（2019年）采用了一種特殊方法，在完整的葉片上應用了高度復雜的時間分辨熒光光譜法，“避免了影響熒光衰減痕跡的任何可能的光學人工干擾”，特別關注了PS I熒光的貢獻。但并未觀察到Fv（I）。在這種情況下，重要的是要認識到Fv（I）是一種瞬態(tài)現(xiàn)象，它會被預照光抑制。在PSⅠ抑制劑存在下，最大PSⅠ熒光不能簡單地由光照誘導，類似于在DCMU存在下Fm（II）的誘導。據(jù)我們所見，只有在使用可誘導重復顯示明顯I2-P相的樣品進行測量的情況下，才有可能通過時間分辨熒光光譜法確認活體內(nèi)Fv（I）的證據(jù)。在圖9和圖10的條件下對藍藻進行測量應該不是一個太難的任務。

Schreiber教授在文章引言中表示，對于像他和Christof Klughammer這樣的儀器開發(fā)者來說，沒有什么比看到有能力的研究人員對我們的新設備進行最佳利用更值得的了。有鑒于此，我們衷心感謝澳大利亞國立大學Fred Chow用PAM儀器進行的所有精彩實驗。我們將這篇關于PS-I在體內(nèi)的可變熒光的交流獻給他，希望我們的發(fā)現(xiàn)能幫助他發(fā)現(xiàn)更多復雜的光合作用拼圖中的小片段。也許現(xiàn)在一起尋找還不晚。