細胞活力的測定在生命科學(xué)和生物技術(shù)的許多領(lǐng)域都是必不可少的環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)上，細胞活力通常通過寬視野光學(xué)顯微照片中染色細胞的半自動或自動計數(shù)來確定，通常這種檢測方法需要額外的染色標(biāo)記過程，故很難作為在線或原位快速檢測的手段。Ampha Z32微流控阻抗流式細胞儀（IFC）是一種基于Coulter原理的無需標(biāo)記的單細胞檢測技術(shù)，可在線快速、準(zhǔn)確測定懸浮液中單細胞的活性狀態(tài)。Ampha Z32不含光學(xué)元件，無需調(diào)整和校準(zhǔn)，便于攜帶，不僅可在實驗室使用，還同樣適用于實驗室外的檢測。此前，Ampha Z32多用于花粉質(zhì)量分析，但目前其也逐步應(yīng)用到細胞生物學(xué)的許多領(lǐng)域，如檢測癌細胞的活力、分化和凋亡（Ampha Z32阻抗流式細胞儀在癌細胞狀態(tài)鑒定中的應(yīng)用）；監(jiān)測牛紅細胞寄生蟲感染過程；成纖維細胞分化為脂肪細胞的研究；甚至是納米材料毒性評估（Ampha Z32阻抗流式細胞儀在納米材料毒性篩選中的應(yīng)用）等方面。本文利用Ampha Z32精確并快速的評估了正常和熱滅活、發(fā)酵過程中以及長期好氧間歇培養(yǎng)過程中酵母細胞的細胞活力和細胞狀態(tài)，并與常規(guī)染色方法進行了比較。此外，還監(jiān)測了感染桿狀病毒后昆蟲細胞活性的變化并預(yù)測了胞內(nèi)蛋白的理想收獲時間。
圖1 IFC法與PI熒光染色法測定的酵母活性的相關(guān)性A）10MHz頻率下釀酒酵母（Scc ATCC 9080）活細胞（未處理；綠點）和死細胞（熱處理；紅點）的IFC相位角（x軸）-振幅（y軸）疊加散點圖；B）IFC法（n=3，std=0.15%）和染色法（n=3，std=4.4%）的相關(guān)性分析（R2=0.996）IFC法：本實驗中未經(jīng)處理和熱處理的酵母死細胞樣品按預(yù)定比例（1:0、3:1、1:1、1:3、0:1）混合至100μl，之后用AF6緩沖液進一步稀釋至2ml，經(jīng)20μm過濾器過濾后上機測試，三次重復(fù)，細胞采集數(shù)目設(shè)定為20000。PI法：200μl AF6和100μl 3.0μg/ml碘化丙啶（PI）稀釋100μl上述未經(jīng)處理/熱處理的細胞混合物，并使用熒光顯微鏡（Leica）計數(shù)PI染色（死亡）和未染色（存活）細胞。實驗結(jié)果表明，相較于傳統(tǒng)染色鏡檢法，Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC）操作簡單、測量快速，是一種統(tǒng)計性、重復(fù)性、測量精度以及標(biāo)準(zhǔn)化程度都更高的檢測方法。常規(guī)培養(yǎng)下和兩性霉素B（Sigma）處理后釀酒酵母活性的變化
圖2 常規(guī)培養(yǎng)下釀酒酵母（Scc ATCC9080）活性的變化（IFC法）
圖3. 常規(guī)培養(yǎng)下和兩性霉素B（Sigma）處理后釀酒酵母活性的變化A）常規(guī)培養(yǎng)下，釀酒酵母（Scc ATCC 9080）活性相位直方圖隨時間的變化（10 MHz）。C）在添加1μg/ml的兩性霉素B后的0-5h內(nèi)，釀酒酵母（Scc ATCC 9080）活性相位直方圖的變化釀酒酵母（Scc ATCC 9080）常規(guī)培養(yǎng)，即250 ml錐形瓶中在28°C的搖動培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天，培養(yǎng)基為100 ml YPD。兩性霉素B（Sigma）處理，即將常規(guī)培養(yǎng)中處于指數(shù)生長時期的釀酒酵母細胞暴露于1μg/ml的兩性霉素B中。圖2為接種培養(yǎng)后的第1、7和14天，釀酒酵母的相位-振幅散點圖的變化，從圖中可以看出，在接種培養(yǎng)的第7天出現(xiàn)兩個明顯可區(qū)分的類群。在培養(yǎng)的18天中，可以清晰看到活性酵母類群的逐漸向低相位和較小振幅移動（圖3A），也就是說，隨著培養(yǎng)時間的延長，酵母細胞活性逐漸下降（圖3B）。此過程反映了在長期好氧間歇培養(yǎng)中，因營養(yǎng)限制而導(dǎo)致的酵母細胞的死亡過程。圖3C同樣觀察到經(jīng)兩性霉素B（Sigma）處理后，釀酒酵母細胞的活性逐漸降低，但這一過程反映的是毒性化合物誘導(dǎo)下酵母細胞的死亡過程。這表明IFC還可應(yīng)用于懸浮細胞的無標(biāo)記毒理學(xué)研究，例如用于IC50值的測定。
A） 開始發(fā)酵后的前3天，酵母細胞的相位-振幅散點圖變化。B） 發(fā)酵過程中的酵母細胞的密度（黑色）、活力（橙色）和乙醇濃度（藍色）隨時間的變化。啤酒釀造發(fā)酵罐中的生長條件與前面討論的情況不同，圖4記錄了酵母的發(fā)酵過程，開始的第1天（紅色）到第2天（綠色），酵母細胞呈指數(shù)增殖，細胞濃度從5.4增加到25.3 x 106細胞/ml，細胞活力從57.1增加到83.9%（圖4B）。第3天結(jié)束時，酵母細胞（藍色）移向較低的相角，這意味著細胞濃度的增長減慢，細胞活力下降。而發(fā)酵罐中乙醇濃度從第一天的0.1%迅速增加到第三天的3.1%（圖4B）。這是由于培養(yǎng)第一天細胞濃度低、活力低且發(fā)酵罐中仍存在大量氧氣，當(dāng)發(fā)酵罐中的氧氣全部消耗完后，酵母轉(zhuǎn)入?yún)捬跻掖及l(fā)酵，乙醇濃度迅速增加，而乙醇濃度增加又會對酵母細胞產(chǎn)生毒性，故酵母細胞活性降低。IFC的檢測到的活性相位變化與以上響應(yīng)過程高度一致。本文利用Ampha Z32（IFC）分別跟蹤了感染和未感染染桿狀病毒（BV）的Sf9昆蟲細胞培養(yǎng)物在首次傳代后的99h內(nèi)的活力變化。
圖5 感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲細胞活性的變化
圖S4 感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲細胞活性相位疊加圖上圖為Sf9昆蟲細胞在感染桿狀病毒后的數(shù)小時（hpi）內(nèi)，相位-振幅散點圖的變化（0hpi為感染前的參考培養(yǎng)物）。在BV感染從0到99 hpi的整個過程中，相位-振幅散點圖的可明顯分離出三個細胞類群，分為是活細胞（viable）、感染晚期（LPI）和死細胞（dead）類群（圖5）。類似于酵母（圖1），在較高的相位值（150?到220?）下分離出“活”細胞類群。這部分活細胞在感染后的0-48hpi，阻抗振幅增加了約60%，這與感染后細胞的“膨脹”狀態(tài)相一致。阻抗振幅的變化提供了感染水平的定量讀數(shù)，可用于從病毒滴定分析中確定病毒與細胞比率（感染多重性，MOI）。48hpi后，活細胞的阻抗振幅降低（細胞萎縮）且數(shù)量逐漸減少，直至99hpi細胞全部死亡（見圖6）。感染晚期（LPI）細胞類群出現(xiàn)在較低相位，這部分細胞在0-60hpi逐漸增加隨后減少直至消失，這是由于感染后期的細胞裂解所致。
圖S3 未感染桿狀病毒（BV）的Sf9昆蟲細胞活性的變化上圖為未感染桿狀病毒（BV）的Sf9昆蟲細胞活性的變化，同感染細胞一致，相位-振幅散點圖也可分離出活細胞（viable）、感染晚期（LPI）和死細胞（dead）類群。如圖所示，細胞活力(97.9 %±0.7 %)在79 hpi的連續(xù)生長過程中始終保持不變。僅當(dāng)在99 hpi超過典型的繼代間隔時間時，細胞活力下降至約93.1%，這可能是由于營養(yǎng)限制或細胞密度過高所致。與感染的Sf9昆蟲細胞的相位-振幅散點圖（圖5）相比，未感染細胞的振幅分布（與細胞大小相關(guān)）在0-60h內(nèi)略有變窄，而直到60h才明顯檢測到LPI（感染晚期）細胞類群，到99h時該類群略有增加。感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲細胞活力和重組蛋白表達的時間動力學(xué)變化本文除利用IFC法、臺盼藍染色鏡檢法追蹤了感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲細胞活性的動力學(xué)變化，還同時利用綠色熒光蛋轉(zhuǎn)染Sf9細胞以量化重組蛋白的產(chǎn)量，下圖為感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲細胞活力和重組蛋白表達的時間動力學(xué)變化。
圖6 感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲細胞活力和重組蛋白表達的時間動力學(xué)變化結(jié)果表明，在感染BV后的24hpi內(nèi)，IFC法與臺盼藍成像細胞計數(shù)器的檢測結(jié)果高度一致；24-60hpi內(nèi)，IFC法檢測到的活性快速下降到50%（紅實線），而臺盼藍成像細胞計數(shù)器檢測到的細胞活性下降緩慢，僅從100%下降到80%（藍實線）；從60hpi后，細胞活性均快速下降，但到99hpi時，IFC法的檢測結(jié)果僅為5%，而臺盼藍成像細胞計數(shù)器的檢測結(jié)果為42%；整個測試過程中，兩者差異在79hpi時達到最大，分別為11%和78%。79hpi的相位-振幅散點圖（圖5）表明此時IFC法可以準(zhǔn)確捕捉到細胞阻抗信號發(fā)生了巨大變化（細胞的大規(guī)模重組），而臺盼藍成像細胞計數(shù)器卻不能及時檢測到這一變化。在BV感染的不同階段，細胞大小有顯著差異。因此，臺盼藍成像細胞計數(shù)法通常用細胞大小表征BV感染的狀態(tài)和重組蛋白的產(chǎn)量質(zhì)量。如圖7所示，在23-60 hpi之間，感染細胞從最初的12.8μm膨脹到約16μm，然后在99 hpi時最終縮減到8.5μm（圖7A，紅色虛線）。這與IFC法獲得的平均振幅（圖7A，黑色虛線）的變化趨勢非常相似，分析表明，振幅數(shù)據(jù)與平均細胞大小有很好的相關(guān)性（R2=0.901）（圖7B）。也就是說IFC法不僅可以評估細胞的活力，還可以評估細胞的大小。
圖7 感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲細胞大小的變化LPI（感染晚期）類群大小與重組蛋白產(chǎn)量的關(guān)系相較于臺盼藍成像細胞計數(shù)法，IFC法可進一步將失活細胞區(qū)分為感染晚期（LPI）和死細胞（dead）兩個類群（圖5）。隨感染時間的延長，LPI類群的細胞在48-60 hpi內(nèi)逐漸增多，到72 hpi幾乎全部消失。這一類群的大小與裂解細胞中檢測到的表達trGFPuv的濃度相關(guān)（圖6，紅色虛線和黑色實線）。隨著BV感染的進一步發(fā)展，表達的trGFPuv隨細胞裂解釋放到培養(yǎng)基中（圖6，黑色虛線），其濃度的變化與IFC確定的死亡細胞總數(shù)的比例完全一致（圖6，紅色虛線）。盡管細胞外表達的trGFPuv的數(shù)量最終會超過細胞內(nèi)的trGFPuv，但培養(yǎng)基中的不必要反應(yīng)和裂解細胞釋放的蛋白酶可能會降低表達蛋白的質(zhì)量，因此研究者并不希望將這部分釋放的蛋白質(zhì)用于后續(xù)應(yīng)用。由于IFC法檢測到的LPI群體與表達的胞內(nèi)蛋白密切相關(guān)，因此利用Ampha Z32（IFC）可以很好地預(yù)測胞內(nèi)蛋白的理想收獲時間。以上研究表明，Ampha Z32（IFC）微流控阻抗流式細胞儀是一種快速、可靠、無標(biāo)記的細胞活力檢測技術(shù)。不僅可以在發(fā)酵過程中可靠測定細胞活力，細胞大小的變化，評估培養(yǎng)條件；還可以在昆蟲細胞bv感染過程中篩選理想的表達條件、病毒滴度，預(yù)測BV昆蟲細胞系統(tǒng)中獲得胞內(nèi)蛋白的理想時間，可廣泛應(yīng)用于微生物和動物單細胞的培養(yǎng)中。
