全球氣候變暖導(dǎo)致的高溫嚴(yán)重威脅農(nóng)作物產(chǎn)量，而光合作用是作物產(chǎn)量形成的重要因素，同時(shí)也是對(duì)高溫最敏感的生理過程之一，高溫脅迫會(huì)破壞葉綠體功能，包括葉綠素合成、光化學(xué)反應(yīng)效率和電子傳遞鏈活性。因此產(chǎn)生抑制光合作用效率阻礙植物生長(zhǎng)并降低作物產(chǎn)量的負(fù)面作用，然而其分子機(jī)制尚未完全闡明。

高等植物線粒體和葉綠體作為半自主細(xì)胞器含有部分遺傳物質(zhì)，可以轉(zhuǎn)錄編碼自身所需蛋白質(zhì)的RNA，且該RNA存在大量的編輯位點(diǎn)。植物葉綠體和線粒體的RNA編輯(C-U)是校正轉(zhuǎn)錄本錯(cuò)誤的重要過程,異常的RNA編輯可導(dǎo)致植物發(fā)育缺陷和非生物脅迫響應(yīng)失調(diào)。編輯過程依賴于編輯體(editosome)，其核心組分包括：1.PPR蛋白，通過序列特異性識(shí)別靶RNA位點(diǎn)。2.MORF家族蛋白（如MORF8），與PPR蛋白互作，增強(qiáng)其RNA結(jié)合能力。脫氨酶：催化C(胞嘧啶)到U(尿嘧啶)的化學(xué)修飾。MORF8是唯一一種在葉綠體和線粒體中雙重定位的蛋白家族成員，其功能缺失會(huì)導(dǎo)致胚胎致死，表明其在RNA編輯中的核心地位。RNA編輯對(duì)葉綠體中光合作用相關(guān)基因的調(diào)控至關(guān)重要，而熱脅迫則顯著抑制這一過程。那么熱脅迫是如何調(diào)控RNA編輯過程的？熱脅迫對(duì)光合作用的影響是否能夠通過對(duì)RNA編輯過程的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)？

2025年3月21日，Nature Communications在線發(fā)表了清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院方曉峰課題組題為“Solid-like condensation of MORF8 inhibits RNA editing under heat stress in Arabidopsis”的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)，葉綠體定位的MORF8蛋白能夠在熱脅迫下形成固態(tài)凝聚體，并招募特定的RNA編輯因子PPR蛋白進(jìn)入凝聚體中以減弱PPR蛋白與其靶向RNA的結(jié)合能力，從而降低葉綠體中對(duì)應(yīng)RNA位點(diǎn)的編輯效率，最終導(dǎo)致光合膜蛋白復(fù)合體(如NDH-PSI)活性受損，光合作用效率下降(下圖)。

MORF8蛋白相分離工作模型。正常溫度條件下，MORF8促進(jìn)PPR蛋白與RNA結(jié)合；熱脅迫誘導(dǎo)條件下，固態(tài)凝聚體形成，隔離編輯體組分，抑制NDH復(fù)合體功能。

該研究發(fā)現(xiàn)，RNA編輯因子MORF8能夠特異性地響應(yīng)熱脅迫發(fā)生相分離。42°C處理10分鐘后，葉綠體內(nèi)MORF8凝聚體數(shù)量增加5倍(圖1a)。FRAP顯示熒光恢復(fù)率僅8%(圖1d)，且1,6-己二醇處理不溶解凝聚體(圖1e)。此外，體外數(shù)據(jù)表明，IDR(蛋白質(zhì)固有無(wú)序區(qū)域)是相分離的關(guān)鍵，ΔIDR突變體完全喪失凝聚能力(圖2e)。DLS(動(dòng)態(tài)光散射)顯示IDR單獨(dú)響應(yīng)溫度變化，37°C時(shí)粒徑從10 nm增至250 nm(圖2j)。上述結(jié)果表明MORF8通過IDR直接感知溫度，形成固態(tài)凝聚體，可能通過降低蛋白流動(dòng)性實(shí)現(xiàn)持久脅迫響應(yīng)。在煙草和擬南芥中的一系列實(shí)驗(yàn)也都證實(shí)了MORF8的凝聚體是固態(tài)的，并且能夠通過離心分離獲得凝聚體組分。

圖1 MORF8蛋白響應(yīng)熱脅迫形成固態(tài)凝聚體。

圖2 MORF8蛋白的體外相分離特性

MORF8凝聚抑制RNA編輯效率方面的研究數(shù)據(jù)表明，amiR-MORF8植株中，23/34個(gè)葉綠體編輯位點(diǎn)效率下降>50%(圖3a)；過表達(dá)MORF8導(dǎo)致16個(gè)位點(diǎn)(如ndhD-2)效率降低30%-90%(圖3b)。生化機(jī)制相關(guān)的EMSA分析顯示，MORF8凝聚體將PPR蛋白DGI與ndhD RNA的結(jié)合減少70%(圖5c-e),表明進(jìn)入凝聚體的PPR蛋白與靶標(biāo)RNA的結(jié)合能力顯著降低，這意味著MORF8的聚集是不利于有活性的編輯體組裝的。質(zhì)譜鑒定到CRR21等PPR蛋白被招募至凝聚體(圖4e-g)。上述研究結(jié)果表明固態(tài)凝聚體通過隔離編輯體組分抑制RNA結(jié)合，且不同刺激(過表達(dá)vs.熱脅迫)可能動(dòng)態(tài)改變凝聚體組成。

該研究進(jìn)一步評(píng)估了NDH復(fù)合體功能受損對(duì)光合作用的影響。蛋白表達(dá)水平方面，免疫印跡顯示，熱脅迫8小時(shí)后NdhH蛋白減少60%(圖6d)。BN-PAGE顯示NDH-PSI超復(fù)合體減少50%(圖6f)，葉綠素?zé)晒夥治霰砻鱊DH活性下降65%(圖6e)。ndhD-2編輯缺陷導(dǎo)致NDH復(fù)合體組裝失敗，破壞PSI循環(huán)電子傳遞，加劇光抑制和ROS積累。總之研究者通過對(duì)一系列體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和光合作用相關(guān)參數(shù)的比較分析，建立了MORF8蛋白的相變與光合作用調(diào)控機(jī)制的耦合關(guān)系(圖6)。

圖6 MORF8凝聚損害NDH活性與光合作用

綜上所述，本研究首次揭示MORF8蛋白通過固態(tài)相分離調(diào)控葉綠體RNA編輯的熱響應(yīng)機(jī)制，闡明了高溫抑制光合作用的分子通路。量化數(shù)據(jù)表明，熱脅迫通過降低關(guān)鍵編輯位點(diǎn)效率(如ndhD-2編輯效率下降60%)，導(dǎo)致NDH活性喪失和光合損傷。這一發(fā)現(xiàn)為作物抗逆性改良提供了新靶點(diǎn)，并拓展了相分離在植物逆境生物學(xué)中的研究維度。

Wu, J., Wang, Y., Chen, H. et al. Solid-like condensation of MORF8 inhibits RNA editing under heat stress in Arabidopsis. Nature Communications 16, 2789 (2025). 

如圖6.e所示，使用PAM葉綠素?zé)晒鈨x(如PAM-2500，DUAL-PAM-100等)測(cè)量光化光關(guān)閉后葉綠素?zé)晒馑矔r(shí)上升的動(dòng)力學(xué)軌跡(Post-illumination transient increase in chlorophyll fluorescence)可以用來表征NDH介導(dǎo)的環(huán)式電子傳遞活性，因此該方法也稱為NDH活性測(cè)量。該方法測(cè)量的流程非常簡(jiǎn)單，使用暗適應(yīng)的葉片先在測(cè)量光下記錄最小熒光Fo，之后用光化光誘導(dǎo)樣品達(dá)到穩(wěn)態(tài)，最后關(guān)閉光化光記錄熒光信號(hào)的上升。根據(jù)作用光關(guān)閉后熒光信號(hào)上升曲線的斜率來評(píng)定循環(huán)電子傳遞的快慢，斜率越大，循環(huán)電子傳遞速率越快，反之越慢。

圖片來自《光合作用研究技術(shù)》

使用PAM熒光儀測(cè)量NDH活性的操作要點(diǎn)如下：

1、表征NDH活性的測(cè)量對(duì)象為PSII熒光(Fluo)。

2、建議使用毫秒(1ms)級(jí)時(shí)間分辨率采集熒光動(dòng)力學(xué)曲線。

3、測(cè)量光低頻(MF-L)不宜太低，建議設(shè)置為500-1000Hz。

4、為了使樣品初始狀態(tài)沒有光抑制或記憶效應(yīng)的影響，建議暗適應(yīng)后或在低光強(qiáng)下開始并避光測(cè)量。暗適應(yīng)樣品可以測(cè)FoFm，低光強(qiáng)下開始就無(wú)需測(cè)FoFm了。

5、PAM熒光儀支持手動(dòng)進(jìn)行一次完整測(cè)量動(dòng)作后保存測(cè)量流程，重復(fù)測(cè)量。

使用PAM熒光儀測(cè)量NDH活性的操作流程如下：

1、慢速動(dòng)力學(xué)曲線窗口將運(yùn)行模式改為Manual。

2、將樣品加在暗適應(yīng)葉夾，如果是開放葉夾(如2035-B葉夾或DUAL-PAM-100的探頭)需遮蔽環(huán)境光。

3、打開測(cè)量光，觀察Ft(或Fluo)信號(hào)值，建議使Ft(或Fluo)在0.2-0.6之間，比如0.3或0.4。確認(rèn)Ft(或Fluo)滿足測(cè)量要求后，關(guān)閉測(cè)量光。

4、選擇一個(gè)中低強(qiáng)度的光化光作為誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的光強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)室/溫室等室內(nèi)培養(yǎng)的植物，建議50-100 μE，室外植物可以考慮使用略高的光強(qiáng)，如100-200 μE。 

5、在Manual模式下開始(Start)慢速動(dòng)力學(xué)曲線(Slow Kinetics)。

6、等待3-5秒，讀取基線，此時(shí)熒光信號(hào)應(yīng)該為0。

7、打開測(cè)量光，熒光信號(hào)上升至預(yù)設(shè)值(比如0.3或0.4)。

8、等待3-5秒，讀取只有測(cè)量光時(shí)的基線，此時(shí)熒光信號(hào)應(yīng)該為一條接近水平的線。

9、如果需要，可以點(diǎn)擊[FoFm]，測(cè)量Fv/Fm，如果不需要，可省略此步驟。

10、打開光化光，直至熒光曲線走平穩(wěn)定。

11、關(guān)閉光化光，直至曲線鼓起后再下降至走平穩(wěn)定。

12、點(diǎn)擊Stop，結(jié)束慢速動(dòng)力學(xué)曲線(Slow Kinetics)13，手動(dòng)關(guān)閉測(cè)量光

13、如果您用的是PAM-2500，測(cè)量完成后，在慢速動(dòng)力學(xué)曲線窗口將運(yùn)行模式改為Trig. Run，會(huì)彈出一個(gè)對(duì)話框，用來保存剛才的操作流程。您可以看到動(dòng)作的時(shí)間節(jié)點(diǎn)是毫秒(ms)。根據(jù)個(gè)人需要，可以將時(shí)間節(jié)點(diǎn)改為整數(shù)后保存。后續(xù)實(shí)驗(yàn)只需更換樣品后，在Trig. Run模式下點(diǎn)Start即可。

14、如果您使用的是DUAL-PAM-100，測(cè)量完成后需要點(diǎn)擊曲線右邊的“Copy Trig. Run from Man. Rec”按鈕，將剛才手動(dòng)執(zhí)行的所有操作Copy到Settings→ Trig. Run窗口并生成Trigger文件。點(diǎn)擊保存，存儲(chǔ)Trigger文件用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用即可。后續(xù)實(shí)驗(yàn)只需更換樣品，將慢速動(dòng)力學(xué)曲線(Slow Kinetics)運(yùn)行模式改為Trig. Run，點(diǎn)擊Start即可。

15、將Manual和Trig. Run測(cè)量的慢速動(dòng)力學(xué)曲線導(dǎo)出，截取光化光關(guān)閉前-后時(shí)間區(qū)間內(nèi)的動(dòng)力學(xué)軌跡作圖，分析即可。

注1：PAM軟件里，μE=μmol m?2 s?1

注2：早期的培訓(xùn)資料里，NDH活性的測(cè)量還可以通過Script完成，后來由于Script的執(zhí)行時(shí)間節(jié)點(diǎn)為秒(s)，導(dǎo)出數(shù)據(jù)作圖時(shí)時(shí)間節(jié)點(diǎn)無(wú)法完全統(tǒng)一，使用越來越少了。

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