孢子萌發(fā)對于細(xì)菌定殖是必要的第一步，孢子在結(jié)腸中的萌發(fā)速率依賴于宿主菌群的組成，宿主菌群可調(diào)控初級及次級膽鹽水平以控制艱難梭菌的孢子萌發(fā)。Biosensors and Bioelectronics上發(fā)表了一項最新研究，基于萌發(fā)的孢子有著更高的凈電導(dǎo)率這一特征，開發(fā)了一種基于阻抗檢測的高通量單細(xì)胞計數(shù)法（Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀，瑞士Amphasys），僅需4小時（傳統(tǒng)方法需24小時）即可評估艱難梭菌的孢子萌發(fā)情況，并可用于評估宿主菌群對艱難梭菌感染的易感性。
① 利用高通量單細(xì)胞阻抗計數(shù)法（>300 events/s）對活細(xì)菌細(xì)胞進行定量；
② 相比于傳統(tǒng)的菌落分析方法（需24h），該方法僅需培養(yǎng)4h即可評估孢子萌發(fā)情況，檢測下限為每50μL樣本中約100個活細(xì)胞；
③ 萌發(fā)的艱難梭菌孢子有更高的凈電導(dǎo)率，這在中等導(dǎo)電介質(zhì)（0.8S/m）內(nèi)造成了獨特的高頻（10 MHz）阻抗相分散（活細(xì)胞與失活細(xì)胞離散）；
④ 該方法可對比在不同的初級膽鹽水平下的艱難梭菌孢子萌發(fā)速率，并可用于評估宿主對艱難梭菌感染的易感性。
圖1（a） 艱難梭菌孢子萌發(fā)到其營養(yǎng)體形式受到“正常”菌群中共生細(xì)菌的抑制，該菌群分泌水解酶，能夠代謝初級膽鹽為次級膽鹽，而缺乏共生細(xì)菌的抗生素破壞菌群表現(xiàn)出較高的初級至次級膽鹽水平，導(dǎo)致孢子萌發(fā)增強；（b） 整體實驗時間表：包括孢子預(yù)處理、細(xì)菌生長、IFC（阻抗流式細(xì)胞儀）微流控表型分析和菌群驗證；（c）阻抗式細(xì)胞儀分析的具體樣品制備步驟；（d） 來自抗生素處理的小鼠模型的宿主菌群樣本的采集、制備和分析步驟。圖2 艱難梭菌UK1孢子在不同水平?；悄懰猁}的標(biāo)準(zhǔn)生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的微生物學(xué)分析圖2（a） 24小時內(nèi)的生長曲線顯示，隨著牛磺膽酸鹽水平的增加，孢子萌發(fā)率逐漸提高，由于營養(yǎng)性艱難梭菌的存在， 0.001% 、0.01%和 0.1%?；悄懰猁}水平下的吸光度分別在20h、18h、15h（用虛線標(biāo)記）與無?；悄懰猁}的對照組的吸光度相比，出現(xiàn)顯著差異（*p<0.05）；（b） 24小時后的CFU分析結(jié)果顯示，含有0.1%?；悄懰猁}的生長培養(yǎng)基的孢子萌發(fā)顯著（****p<0.0001），而其他?；悄懰猁}水平下孢子萌發(fā)并不明顯；（c）培養(yǎng)4小時后的DEP歸一化光譜和頻譜結(jié)果顯示，含有0.1%?；悄懰猁}的DEP歸一化光譜與同質(zhì)營養(yǎng)體艱難梭菌勻質(zhì)樣品的DEP歸一化光譜（實線）極為相似，根據(jù)異質(zhì)樣本的凈電生理特性可以推斷，在0.1%牛磺膽酸處理的樣本中存在營養(yǎng)體艱難梭菌亞群，這與傳統(tǒng)法分析（圖2a和b）的評估結(jié)果一致，但檢測可在更短時間內(nèi)進行（4小時.VS >15小時）。圖3 營養(yǎng)體艱難梭菌細(xì)胞和孢子的多殼層介電模型&均質(zhì)種群的歸一化DEP光譜
圖3（a） 基于營養(yǎng)體細(xì)胞和孢子的大小、形狀和結(jié)構(gòu)差異，生成多殼層介電模型；（b） 營養(yǎng)體細(xì)胞和孢子均質(zhì)種群的歸一化DEP光譜結(jié)果表明，不同樣品類型的極化和電生理特性存在明顯差異。低于100 kHz的電場頻率下，營養(yǎng)體艱難梭菌細(xì)胞因絕緣細(xì)胞外殼表現(xiàn)為nDEP（負(fù)DEP），但在高于1 MHz的電場頻率下，營養(yǎng)體艱難梭菌因細(xì)胞內(nèi)部的導(dǎo)電細(xì)胞質(zhì)而發(fā)生極化，表現(xiàn)出pDEP（正DEP）。圖4 不同頻率、介質(zhì)電導(dǎo)率下，艱難梭菌活細(xì)胞營養(yǎng)體與熱滅活后的艱難梭菌細(xì)胞的阻抗數(shù)據(jù)（相位-振幅）疊加圖（IFC法）由于孢子萌發(fā)過程中樣品的異質(zhì)性，研究可利用Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀（IFC法）通過檢測營養(yǎng)體艱難梭菌的電生理學(xué)特征來鑒定孢子萌發(fā)，并量化營養(yǎng)體艱難梭菌的比例。圖4為不同頻率（0.5 MHz (a & d)、2 MHz (b & e)、10 MHz (c & f)）、不同介質(zhì)導(dǎo)電條件（0.5× PBS（a-c）、1× PBS（d–f) ）下，艱難梭菌活細(xì)胞營養(yǎng)體與熱滅活后的艱難梭菌細(xì)胞的阻抗數(shù)據(jù)（相位-振幅）疊加圖。對比可知，0.5× PBS（介質(zhì)電導(dǎo)率為 0.8 S/m），10 MHz 下二者的區(qū)分度最佳，篩選門控可設(shè)于218°相位處（圖4c實線），此時艱難梭菌活細(xì)胞占比＞95%。圖5 不同牛磺膽酸鹽水平、不同培養(yǎng)時間下艱難梭菌活細(xì)胞的占比（IFC法：0.5× PBS，10 MHz）圖5顯示孢子萌發(fā)率隨生長培養(yǎng)基中?；悄懰猁}水平以及萌發(fā)時間的增加而增加，其中0.1% ?；悄懰猁}的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng) 4 小時后，孢子萌發(fā)率約為 30%（每50μL 樣品約 250 個營養(yǎng)體艱難梭菌細(xì)胞），而0.05–0.1%?；悄懰猁}的生長培養(yǎng)基中萌發(fā) 5 小時后，孢子的萌發(fā)率可達(dá)80%以上；該測定結(jié)果表明艱難梭菌對培養(yǎng)時間和生長培養(yǎng)基中初級膽汁鹽（?；悄懰猁}）比例的變化表現(xiàn)出良好的敏感性。圖6 未處理和抗生素處理的艱難梭菌孢子萌發(fā)實驗比較（宿主菌體外菌群）本研究使用從小鼠模型獲得的體外菌群樣品進一步驗證了實驗結(jié)果的可靠性。在使用克林霉素進行抗生素治療10天后，按照圖1d的步驟進行了艱難梭菌孢子萌發(fā)實驗。CFU分析（圖6a）結(jié)果顯示，未經(jīng)處理的菌群的孢子發(fā)芽率明顯較低，而克林霉素處理的菌群培養(yǎng)24小時后，孢子萌發(fā)水平顯著提高（**p<0.01），表明抗生素處理后菌群多樣性的減少可能會提高艱難梭菌的萌發(fā)率，這與此前的研究結(jié)果一致。而使用阻抗流式細(xì)胞儀（IFC法）在培養(yǎng)4小時后即可檢測出未處理和抗生素處理的艱難梭菌孢子萌發(fā)率（***p<0.001，圖6b）和孢子數(shù)量（**p<0.01，圖6c）上的顯著差異。這表明與CFU法相比，IFC法具有更高的靈敏性，可以更早檢測出宿主菌群對艱難梭菌孢子萌發(fā)的敏感性差異（4h與 24 h）。綜上所述，Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀（IFC法）可用于識別艱難梭菌營養(yǎng)體，量化宿主菌群對艱難梭菌孢子萌發(fā)率的影響，并在較短時間內(nèi)檢測出宿主菌群對艱難梭菌孢子萌發(fā)的敏感性差異。該方法檢測靈敏度高、測量快速、樣品制備簡單，有潛力進一步用于CDI臨床測量的基準(zhǔn)測試，調(diào)查抗生素治療下腸道菌群隨時間變化的敏感性差異，并通過初始和復(fù)發(fā)艱難梭菌感染的易感性指導(dǎo)臨床管理決策。John H. Moore et al. Quantifying bacterial spore germination by single-cell impedance cytometryfor assessment of host microbiota susceptibility to Clostridioides difficileinfection. Biosensors and Bioelectronics, Volume 166, 2020, 112440, ISSN0956-5663.
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